A unique and essential receptor for Toxoplasma and Plasmodium : from structure and function to new antiparasitic therapeutic strategies
Un récepteur unique et essentiel au Toxoplasma et au Plasmodium : de la structure-fonction vers de nouvelles stratégies thérapeutiques antiparasitaires
Résumé
Apicomplexa is a phylum of obligate intracellular protozoan parasites responsible for serious diseases in both humans and animals. T. gondii and P. falciparum are notable members of this phylum and possess, like their counterparts, an assortment of exclusive apical secretory organelles (micronemes and rhoptries) that orchestrate their entry into the host cell. Micronemes are involved in motility, attachment, and finally escape from the host cell after parasite replication. Rhoptry proteins act in synergy with microneme proteins to enable invasion and are involved in the hijacking of host functions and the establishment of the parasitophorous vacuole. In T. gondii, our model of study, these organelles are dependent on TgSORT, a transmembrane cargo receptor residing in the post-Golgi and endosome-like compartment (ELC) that sorts proteins from these organelles. Indeed, the N-terminal domain (TgN-SORT) binds microneme and rhoptry proteins to transport them in the ELC in order to allow the biogenesis of these organelles. The receptor is thus essential for the virulence and survival of the parasite. TgSORT is homologous to human sortilin, a multifunctional receptor required for protein transport to lysosome using a mannose-6-phosphate independent pathway. A homolog is also present in P. falciparum where it plays an equally crucial role for parasite survival. The main objective of this thesis is to study mechanisms of interaction between TgSORT and its ligands. Using the yeast Pichia pastoris, we successfully expressed and purified TgN-SORT, which was previously insoluble when expressed in E. coli. We also produced its partners MIC5, ROP18 and ROP16. In addition, we performed cryoEM experiments of TgN-SORT, which showed that TgN-SORT has a toroidal structure, which is consistent with predictions. This observation was confirmed by the powerful Alphafold 2 algorithm, which allowed us to obtain with a satisfying confidence score the 3D structure of TgSORT. This structure is similar to that of human sortilin and is in the form of 10 β-propeller domains arranged as a helix followed by two 10CC motifs with a central tunnel. In the parasite, three loops are found outside the tunnel. In addition, Alphafold 2 revealed direct binding between TgN-SORT and rhoptries proteins through the same motifs that human sortilin uses to bind neurotensin. Subsequently, we tested on T. gondii, 12 positive compounds identified from an automated screening of a library of 1121 compounds on a transgenic strain of T. gondii SORT-GFP/ROP1-mCherry that we generated. The objective is to identify small molecules that could profoundly alter the subcellular distribution of the TgSORT receptor and the rhoptries that depend on its biological function. The activities of 4 of the 12 compounds were validated on the reference strain P. falciparum 3D7.
Les Apicomplexa sont un embranchement de parasites protozoaires intracellulaires obligatoires responsables de graves pathologies aussi bien chez l'homme que chez les animaux. T. gondii et P. falciparum sont des membres notables de ce phylum et possèdent, à l'instar de leurs homologues d'un assortiment d'organites sécrétoires apicaux exclusifs (micronèmes et rhoptries) qui orchestrent leur entrée dans la cellule hôte. Les micronèmes interviennent dans la motilité, l'attachement, et enfin l'échappement de la cellule hôte après la réplication du parasite. Les rhoptries agissent en synergie avec les protéines des micronèmes pour permettre l'invasion et sont également impliqués dans le détournement des fonctions de l'hôte et l'établissement de la vacuole parasitophore. Cependant, chez T. gondii, notre modèle d'étude, ces organites sont sous la dépendance de TgSORT, un récepteur cargo transmembranaire résidant dans le post-Golgi et l'ELC et qui assure le tri des protéines de ces organites. En effet, le domaine N-terminal (N-SORT) fixe les protéines des micronèmes et des rhoptries qu'il conduit à l'ELC afin de permettre la biogenèse des protéines des micronèmes et des rhoptries. Il est de ce fait indispensable à la virulence et à la survie du parasite. TgSORT est homologue à la sortiline humaine, un récepteur multifonctionnel requis pour le transport des protéines vers le lysosome par une voie indépendante du mannose-6-phosphate. Un homologue est également présent chez P. falciparum où il joue un rôle tout aussi crucial pour la survie du parasite. Cette thèse a pour objectif principal d'étudier les mécanismes d'interaction entre TgSORT et ses ligands. Nous avons établi un protocole et exprimé dans Pichia pastoris N-SORT, qui était précédemment insoluble lorsqu'elle était exprimée dans E. coli. Nous avons également exprimé ses partenaires MIC5, ROP18 et ROP16. Par ailleurs, nous avons réalisé des expériences de cryoEM de N-SORT qui ont montré que N-SORT présente une structure torique, ce qui est conforme aux prédictions. Cette observation a été confirmée par le puissant algorithme Alphafold 2 qui nous a permis d'obtenir avec un score de confiance satisfaisant la structure 3D de TgSORT. Cette structure est semblable à celle de la sortiline humaine et se présente sous la forme de 10 domaines β-propellers arrangés sous forme d'hélice suivis de deux motifs 10CC avec un tunnel central. Chez le parasite, trois boucles sont retrouvées à l'extérieur du tunnel. En outre, Alphafold 2 a révélé une liaison directe entre N-SORT et les protéines de rhoptries grâce aux mêmes motifs qu'utilise la sortiline humaine pour lier la neurotensine. Par la suite, nous avons testé sur T. gondii, 12 composés positifs identifiés à partir d'un screening automatisé d'une librairie de 1121 composés sur une souche transgénique de T. gondii SORT-GFP/ROP1-mCherry que nous avons générée. L'objectif est d'identifier des petites moléculaires qui pourraient modifier profondément la distribution subcellulaire du récepteur TgSORT et les rhoptries qui dépendent de sa fonction biologique. Les activités de 4 composés parmi les douze ont été validées sur la souche de référence P. falciparum 3D7.
Origine : Version validée par le jury (STAR)